什么是三级淋巴结构？

三级淋巴结构，顾名思义，是一种类似于淋巴结的组织结构，但它们并非先天形成，而是后天在炎症或肿瘤微环境中“临时搭建”的免疫“哨所”。想象一下，当身体的某个部位发生炎症或肿瘤时，免疫系统会在那里迅速集结力量，而TLSs就像是为这些免疫细胞搭建的临时“营地”，让它们能够更好地组织起来，对抗入侵者。

在肿瘤微环境中，TLSs通常由T细胞、B细胞、树突状细胞等多种免疫细胞组成，它们相互协作，发挥着抗肿瘤免疫反应的重要作用。TLSs的存在，就像是在肿瘤周围筑起了一道免疫防线，帮助身体识别和清除肿瘤细胞。

三级淋巴结构已形成专家共识

为了更好地规范和指导TLSs的临床应用，中国专家发布了《非小细胞肺癌三级淋巴结构评估及临床应用中国专家共识（2025版）》。文章指出，TLS在肿瘤微环境中发挥重要作用，与肿瘤的发生、发展及免疫治疗反应密切相关。共识详细阐述了TLS的定义、分类、临床意义、检测方法及评估标准，强调TLS的成熟度、密度、位置等特征对NSCLC患者的预后和免疫治疗疗效具有重要预测价值，其中共识提到的评估TLS技术方法包括HE、IHC、IF和mIHC/

mIF等，并指出使用mIHC/mIF定量分析TLS的密度、大小和数量，以及TLS中各类TILs的组成及浸润丰度，能够综合评估TLS是否存在及成熟度。同时，共识还提出了TLS检测的样本类型、质量控制要求以及评估报告模板等。

三级淋巴结构对肿瘤免疫和临床诊断治疗的意义

肿瘤免疫的“双刃剑”

TLSs在肿瘤免疫中扮演着复杂的角色，可以说是“双刃剑”。一方面，肿瘤内的TLSs（intra-tumoral TLSs）通常与良好的预后相关。这是因为它们能够促进抗肿瘤免疫反应，比如在肝内胆管癌的研究中，肿瘤内TLSs数量越多，患者的生存期越长。这可能是因为这些    TLSs能够有效地激活T细胞，产生针对肿瘤的免疫反应，帮助身体清除肿瘤细胞。

然而，肿瘤周围的TLSs（peri-tumoral TLSs）却可能与不良预后相关。研究发现，肿瘤周围TLSs数量越多，患者的生存期越短。这可能是因为这些TLSs中的免疫细胞组成和功能与肿瘤内的TLSs不同，它们可能被肿瘤微环境“驯化”，从而抑制了抗肿瘤免疫反应，甚至促进了肿瘤的生长和转移。

临床诊断和治疗的新希望

TLSs的研究为肿瘤的临床诊断和治疗带来了新的希望。通过对TLSs的分布、密度和细胞组成的分析，可以对肿瘤患者的预后进行更准确的评估。此外，TLSs的存在也为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。如果能够通过某种方式增强肿瘤内TLSs的功能，或者抑制肿瘤周围TLSs的免疫抑制作用，就有可能提高肿瘤免疫治疗的效果。这为开发新的肿瘤治疗方法提供了新的思路。

mIHC在三级淋巴结构研究中的意义和不可替代性

mIHC技术在TLSs研究中发挥了关键作用，能够同时检测多种标记物，揭示TLSs的细胞组成和功能状态。这为研究人员提供了更全面的视角，帮助他们更好地理解TLSs在肿瘤免疫中的作用。

揭示细胞组成和功能状态：mIHC技术能够在单个组织切片上同时检测多种蛋白质标记物，从而精确识别TLSs中的不同免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞、T滤泡辅助细胞（Tfh）和调节性T细胞（Treg）。这种多维度的检测能力不仅揭示了TLSs的细胞组成，还能通过检测特定标记物的表达水平来评估细胞的功能状态，例如Tfh细胞在TLSs的成熟和抗肿瘤免疫反应中的关键作用，以及Treg细胞对免疫反应的抑制作用。

提供空间分辨率：mIHC技术提供了高空间分辨率，能够精确地定位不同免疫细胞在TLSs中的位置。这对于理解TLSs的组织结构和功能至关重要，因为它允许研究人员区分肿瘤内TLSs和肿瘤周围TLSs，并发现它们在细胞组成和功能上的差异。这种空间分辨率是其他技术（如流式细胞术）所无法提供的，使得mIHC技术在研究TLSs的微环境和功能状态方面具有独特优势。

定量分析能力：结合先进的图像分析软件，mIHC技术能够对TLSs中的细胞密度、频率和分布进行定量分析。这种定量能力使得研究人员能够更准确地评估TLSs的数量和质量，进而揭示其与临床预后的关系。

临床应用前景：mIHC技术在TLSs研究中的应用不仅限于基础研究，还具有重要的临床应用前景。通过mIHC技术，研究人员可以开发新的生物标志物，用于预测患者的预后和治疗反应。例如，通过评估TLSs的数量和功能状态，临床医生可以更准确地制定个性化治疗方案，提高治疗效果。

相关文献解析

2024 年 12 月 11 日，中山大学附属肿瘤医院的夏建川教授团队发表了一篇题为 “TLS and immune cell profiling: immunomodulatory effects of immunochemotherapy on tumor microenvironment in resectable stage III NSCLC”的文章，深入探讨了新辅助免疫化疗对可切除III期非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤微环境（TME）的影响，特别是三级淋巴结构（TLS）和免疫细胞亚群之间的相互作用及其对治疗反应的影响。

研究背景：

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的类型之一，其治疗一直是医学界的难题。尽管手术是可切除 NSCLC 的主要治疗手段，但超过 50% 的患者在术后两年内会出现疾病复发。为了消除可能导致复发的微转移，医学界尝试了多种围手术期治疗方案，但效果有限。近年来，程序性死亡蛋白-1（PD-1）抑制剂在新辅助治疗中的应用取得了突破性进展，显著提高了pCR率（pCR：病理完全缓解，指在切除的肿瘤组织和区域淋巴进行评估后没有残留的肿瘤细胞），但仍有部分患者对治疗无反应。这促使科学家们深入探究肿瘤微环境（TME）中免疫细胞亚群与三级淋巴结构（TLS）之间的复杂相互作用，以期找到更有效的治疗策略。

实验部分：

本研究综合运用了多种前沿技术，包括多色免疫组化（mIHC）、质谱流式细胞术（CyTOF）和流式细胞术，对123例III期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤样本进行了全面分析。这些技术协同作用，深入剖析了新辅助免疫化疗对肿瘤微环境的影响，揭示了免疫细胞亚群的功能重塑及三级淋巴结构（TLS）与治疗反应的关联，如通过CyTOF高维度分析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的动态变化，精准识别关键免疫细胞亚群；流式细胞术用于验证关键免疫细胞；mIHC则通过多种特异性抗体标记细胞表面标志物，直观呈现免疫细胞的空间分布，并运用数据分析软件进一步评估免疫细胞密度、比例及与癌细胞的空间邻近性。

图A-B：展示了使用多色免疫组化（mIHC）对肿瘤切片进行染色的结果，显示了PD-L1（黄色）、CD68（红色）和CD11c（绿色）在TLS中的共表达情况，结果显示CD11c+细胞（树突状细胞）比CD68+细胞（巨噬细胞）表达更多的PD-L1，这表明CD11c+树突状细胞在TLS中可能发挥更重要的免疫调节作用。

图C：展示了使用mIHC对连续组织切片进行染色的结果，通过CD8（青色）、PD-1（绿色）、PD-L1（红色）和CD11c（黄色）的染色标注了TLS的位置。

图D-E：使用HALO软件的空间分析模块分析了CD8+PD-1+细胞与CD11c+PD-L1+细胞之间的距离。结果显示，无反应（NR）患者的CD8+PD-1+细胞与CD11c+PD-L1+细胞之间的平均距离显著短于有反应（R）患者。表明PD-1 抑制剂可能通过阻断CD11c+PD-L1+细胞与 CD8+PD-1+ T细胞之间的相互作用来增强CD8+ T细胞的功能。

图A-B：展示了使用IHC、IF以及mIHC对连续肿瘤切片进行染色的结果，显示了CCR7+CD4+ T细胞在TLS附近的分布及其与B细胞的密切空间关系。图中可以看到，CCR7+CD4+ T细胞主要分布在TLS附近。这些细胞可能通过分泌细胞因子维持B细胞的功能，从而增强TLS的免疫活性。

图A：展示了使用免疫组化对CD8+T细胞进行染色的代表性图像。这些图像根据CD8+T细胞的密度和分布，将患者分为四组。

图B：展示了使用mIHC对肿瘤切片进行染色的结果，PD-1（白色）、CD38（绿色）和 CD8（红色）。图中标注了CD38+CD8+ T细胞与 PD-1 的共定位情况。

图C：比较了不同患者群体中CD38+CD8+ T细胞与总CD8+ T细胞的比例。结果显示，无反应且有CD8+ T细胞浸润（NR-infiltrated）的患者中，CD38+CD8+ T细胞的比例显著高于有反应且有CD8+ T细胞浸润（R-infiltrated）的患者，这一结果表明，CD38+CD8+ T细胞的比例可能与治疗反应呈负相关，意味着这些细胞在肿瘤微环境中发挥着免疫抑制作用。

图D：比较了CD38-和CD38+ CD8+ T细胞上PD-1的表达水平。结果显示，CD38+CD8+ T细胞的PD-1表达显著高于CD38-CD8+ T细胞。这一结果进一步支持了CD38+CD8+ T细胞可能处于更高的免疫抑制状态。PD-1的高表达表明这些细胞可能因PD-1/PD-L1通路的激活而失去功能，从而导致免疫治疗反应不佳。

研究结论

本研究深入分析了新辅助免疫化疗对可切除III期非小细胞肺癌（NSCLC）患者肿瘤微环境（TME）的影响。mIHC 技术在本研究中发挥了关键作用，通过同时标记多种细胞标志物发现免疫化疗显著增加了三级淋巴结构（TLS）的数量和面积，且TLS面积与肿瘤面积的比值可作为预测治疗反应的潜在生物标志物。此外，免疫化疗重塑了免疫细胞亚群的功能，特别是CCR7+CD4+T细胞和CD38+CD8+T细胞。CCR7+CD4+T细胞在TLS附近分布，其PD-1表达降低，可能有助于维持B细胞功能；而CD38+CD8+T细胞比例增加且PD-1表达更高，与免疫抑制相关。这些发现揭示了免疫化疗通过调节TLS和免疫细胞亚群来增强抗肿瘤免疫反应的机制，并为优化治疗策略和开发预测生物标志物提供了重要依据。mIHC技术的高分辨率和多参数分析能力，使得这些发现成为可能，为理解肿瘤微环境的复杂性提供了新的视角。

参考文献：

[1] Lung Cancer Collaboration Group of Tumor Pathology Committee of Chinese Anti-Cancer Association; Expert Committee on Non-small Cell Lung Cancer of Chinese Society of Clinical Oncology. [Chinese Expert Consensus on Assessment and Clinical Application of 
Tertiary Lymphoid Structure for Non-small Cell Lung Cancer (2025 Version)]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2025 Feb 20;28(2):95-104. Chinese. doi: 10.3779/j.issn.1009-3419.2025.102.03. PMID: 40114486; PMCID: PMC11931240.

[2] Yang C, You J, Wang Y, Chen S, Tang Y, Chen H, Zhong H, Song R, Long H, Xiang T, Zhao ZR, Xia J. TLS and immune cell profiling: immunomodulatory effects of immunochemotherapy on tumor microenvironment in resectable stage III NSCLC. Front Immunol. 2024 Dec 11;15:1499731. doi: 10.3389/fimmu.2024.1499731. PMID: 39726591; PMCID: PMC11670196.