研究背景

肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一，其中相当一部分患者会在病程中发展为脑转移。对于携带EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如奥希替尼已成为标准治疗方案，特别是在脑转移中显示出一定的疗效。然而，几乎所有患者最终都会出现耐药，且脑转移灶的耐药发生更早、进展更快，目前对其机制的认识仍不充分。

过去的研究主要集中在肿瘤细胞内的靶点突变和遗传变化，但本研究提出免疫微环境的改变同样可能在耐药过程中发挥关键作用。通过系统分析脑转移灶中免疫细胞的变化，研究发现TKI虽然能增强T细胞浸润，却同时诱导免疫检查点CTLA4的上调，形成功能受限的T细胞群体。这一发现提示，调节免疫微环境，尤其是联合CTLA4抑制，可能为突破脑转移耐药困局提供新的思路。

2024年10月17日，迟喻丹研究员与毛颖教授的研究团队在国际期刊Cancer Cell上发表了题为“Overcoming tyrosine kinase inhibitor resistance in lung cancer brain metastasis with CTLA4 blockade”的重要研究论文。该研究通过联合应用单细胞转录组、mIHC、动物模型等多种手段，系统揭示TKI治疗诱导的免疫重塑如何促进免疫抑制，并提出CTLA4抗体联合治疗策略，有望突破脑转移灶中免疫耐药的瓶颈。

研究亮点

1、TKI增强T细胞浸润，但难以维持有效免疫应答

靶向治疗（如奥希替尼）已成为EGFR突变肺癌脑转移患者的一线用药。作者在本研究中收集了TKI治疗前后的脑转移组织样本，通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）和多重免疫组化（mIHC）双重手段，系统评估了局部免疫微环境的变化。结果显示，TKI治疗后肿瘤中CD3⁺、CD8⁺T细胞的浸润水平显著上升，T细胞在肿瘤核心区域的分布更为密集。

Figure A：实验设计流程图，说明了研究者如何从EGFR突变患者中获取TKI治疗前后的脑转移样本，进行scRNA-seq和mIHC联合分析的流程概览。

Figure B：研究者绘制了UMAP聚类图，对肿瘤浸润免疫细胞进行单细胞聚类，展示各类免疫细胞（T细胞、髓系细胞、树突状细胞等）在不同治疗组中的组成结构。TKI治疗组的样本中，T细胞聚类更集中，尤其是CD8⁺效应T细胞的显著富集，表明TKI可能诱导免疫激活。

Figure C：基于 scRNA-seq 数据绘制的免疫细胞组成比例柱状图。显示在TKI治疗后的样本中，T细胞（特别是CD3⁺）的占比显著升高，而部分髓系细胞减少，提示免疫细胞谱系发生改变。

Figure D：采用mIHC对EGFR突变脑转移样本进行染色，标记CD3等免疫标志物，可直观观察到TKI治疗组中T细胞在肿瘤区域的浸润增强，支持scRNA-seq的发现。

Figure E：对 Figure 1D 图像中CD3⁺ T细胞进行计数和统计，显示TKI治疗组样本中T细胞密度显著高于未治疗组，差异具有统计学意义.

2、TKI通过上调CTLA4的表达来改变T细胞的发育命运，形成免疫抑制微环境

深入分析T细胞亚群后发现，TKI治疗显著改变了T细胞的分化谱系。在TKI组中，CD8⁺ T细胞虽然增多，但伴随着耗竭标志物（如CTLA4）的高表达；与此同时，调节性T细胞（Treg，FOXP3⁺）也同步增多。这表明，TKI治疗后，T细胞不仅数量变化，更重要的是“命运发生了偏移”，逐步走向免疫抑制表型。

Figure D：mIHC图像展示TKI处理后CD8⁺和FOXP3⁺ T细胞在肿瘤组织中密集分布。

Figure J：CTLA4表达在TKI治疗组组织中显著增强，空间定位明确，对应免疫耐受建立的关键过程。

3、肿瘤释放HMGB1激活NF-κB通路，诱导T细胞CTLA4表达

作者进一步追踪了CTLA4上调的诱因，发现在TKI处理的肿瘤细胞中，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）从细胞核释放到胞质并向外分泌。HMGB1作为一种免疫损伤相关分子模式（DAMP），可通过激活T细胞表面TLR5受体，引发NF-κB信号通路激活，进而驱动CTLA4在T细胞中表达升高。

Figure B：mIHC图像显示TKI处理后，HMGB1由核向胞质转位，提示其释放并参与免疫调控。

4、CTLA4抗体联合TKI显著缓解耐药

基于以上发现，作者在EGFR突变小鼠脑转移模型中测试了CTLA4抗体与TKI的联合治疗方案。结果显示，联合用药组相比单用TKI或联合PD1抗体组表现出更强的抗肿瘤效果，包括肿瘤体积缩小、GZMB⁺效应T细胞比例升高、生存期延长等。

Figure D：在小鼠脑转移模型中，采用HE和IHC染色观察CD8⁺GZMB⁺T细胞分布。结果显示，TKI联合CTLA4抗体治疗组中效应性T细胞显著增加，提示免疫杀伤功能增强。

研究意义

本研究深入解析了EGFR突变肺癌脑转移患者在TKI治疗过程中出现免疫耐药的机制，指出肿瘤细胞在TKI作用下释放DAMPs分子HMGB1，通过激活T细胞内NF-κB信号通路，诱导CTLA4上调，从而驱动免疫抑制微环境的形成。这一机制解释了为何T细胞虽在TKI治疗后大量浸润，却无法发挥有效抗肿瘤作用。

更重要的是，研究基于此机制提出并验证了CTLA4抗体联合TKI治疗的新策略，显著改善了动物模型中的免疫激活水平与生存结局，优于传统的PD-1联合方案。这为EGFR突变脑转移患者面临的“靶向耐药、免疫无效”双重困境，提供了潜在的临床突破口。相关机制研究也为免疫治疗在中枢神经系统的应用提供了理论基础和实践依据。

本研究中，多重荧光免疫组化（mIHC）技术在多个关键实验环节中发挥了重要作用。研究团队利用mIHC对TKI治疗前后患者样本中CD3⁺、CD8⁺、FOXP3⁺、CTLA4⁺等免疫细胞的分布与表达水平进行组织切片染色与定量分析，精准揭示了T细胞浸润增强、CTLA4上调及Treg富集等空间免疫变化。相比常规免疫组化，mIHC具备多指标共染、空间定位清晰、细胞级定量等优势，使研究者能够在保留组织结构的前提下解析肿瘤免疫微环境的动态变化，也为验证单细胞测序结果和探索免疫耐药机制提供了关键支持，凸显了mIHC在转化医学研究中的独特价值。

 参考文献：

Fu, Minjie et al. “Overcoming tyrosine kinase inhibitor resistance in lung cancer brain metastasis with CTLA4 blockade.” Cancer cell vol. 42,11 (2024): 1882-1897.e7. doi:10.1016/j.ccell.2024.09.012

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