随着类器官技术不断发展，研究人员已经能够利用人多能干细胞构建具有复杂三维结构的脑、肠、肝、胰腺等类器官模型。针对培养出的类器官，跟2D细胞模型类似，我们也需要观察和鉴定，传统组织学、免疫荧光和多重免疫染色可以提供非常清晰的细胞和分子信息，但通常需要固定、切片、通透、抗体孵育以及荧光标记等步骤。对于完整的3D类器官而言，这些处理不仅可能改变组织结构，也使得对类器官进行连续、无标记的动态观察变得困难。

       2026年发表于Science Advances的一项题为“Label-free biochemical imaging and time point analysis of neural organoids via deep learning-enhanced Raman microspectroscopy”的研究中，Dimitar Georgiev等建立了一套深度学习增强拉曼显微成像（deep learning–enhanced Raman microspectroscopy）平台，将自发拉曼显微光谱与基于自编码器的高光谱解混技术结合，实现了对神经类器官的无标记、生化成像以及2D/3D空间分析。

       该平台不仅能够在完整神经类器官中识别脂质、蛋白质、核酸和糖类等主要生化组分，还进一步在完整类器官内部实现了神经玫瑰结构的三维可视化，并追踪了神经类器官从Day 5到Day 40发育过程中生化组成的变化。

一、为什么类器官需要“无标记成像”？

       类器官与传统二维细胞培养相比，最大的优势之一就是具有更加复杂的三维结构和细胞组成。以脑类器官为例，其内部可以形成神经祖细胞区域、神经元、神经玫瑰结构以及具有一定空间组织特征的细胞群。目前，免疫荧光仍然是类器官研究中最常用的方法之一。通过DAPI、SOX2、MAP2、TUJ1等标志物，可以分别观察细胞核、神经祖细胞以及神经元等结构，具有非常高的分子特异性。

图：神经玫瑰结构（Neural Rosettes）

       然而免疫荧光本质上是一种“目标驱动型”技术，研究者必须先知道“我要找什么”，然后才能选择相应抗体。如果研究目标是某一种未知代谢物、脂质、糖类或者药物分子，传统免疫荧光往往很难直接解决。此外，免疫染色涉及通透、洗涤等过程，可能影响细胞结构，并且一些小分子、代谢物和药物可能在处理过程中发生空间重新分布。

       因此，对于类器官研究而言，一个理想的成像技术应该同时满足：无需外源标记、尽可能少破坏样本、能够获得空间信息，并且能够同时观察多种生化组分。拉曼光谱正是在这样的背景下进入研究人员的视野。

二、什么是拉曼光谱？

       拉曼光谱的发现可追溯至1928年，印度物理学家C.V. Raman首次在实验中观察到光与物质相互作用产生的非弹性散射现象。简单来说：当一束单色激光照射到样品上，绝大多数光子发生弹性散射（瑞利散射（Rayleigh scattering）），频率不变；但极少数光子（约每千万分之一）会与分子振动或转动发生能量交换，导致散射光频率发生偏移，而且不同化学键（C-C、C-H、C=O等）产生的频率偏移具有特征性——就像每个人有自己独一无二的指纹。通过分析这些“分子指纹”，研究人员可以推断样品中蛋白质、脂质、核酸等生物大分子的种类和构象信息。

图：细胞显微拉曼成像示意图

       论文指出，相比红外光谱等其他振动光谱技术，拉曼光谱能够通过分析分子的内源性非弹性光散射，实现非侵入、无标记的化学表征，并且只需要较少的样本前处理。

       然而，拉曼技术在复杂生物样本中的应用长期面临两大障碍：第一，信号极弱。 自发拉曼散射的效率极低（~每千万光子中仅一个发生拉曼散射），这意味着成像速度慢，往往需要数小时才能完成一张高分辨图像。第二，光谱混合。 一个像素点测得的光谱是所有分子信号的叠加——就像一个像素点内可能同时包含蛋白质、脂质、核酸的信号，它们交织在一起，变成一锅大乱炖。如何将这锅“光谱乱炖”拆解成各自纯净的组分信号，是拉曼成像走向应用的核心挑战。

三、深度学习助力拆解混合光谱

       混合光谱的拆解，传统方法往往使用PCA、NMF、VCA、NNLS等进行分析。而本研究进一步使用了一个基于自编码器（autoencoder）的无监督深度学习模型。

其基本思想可以简单理解为：原始拉曼光谱 → Encoder→潜在空间→Decoder→重建原始光谱。其中，Encoder负责从复杂光谱中提取潜在成分及其相对丰度；Decoder则重新构建原始光谱。

       研究者进一步加入了物理约束，使学习得到的endmember和abundance保持非负，同时采用线性混合模型，使模型结果更加符合拉曼光谱的实际物理意义。最终，模型可以将一张复杂的拉曼图像拆分成多个不同的endmembers（端元光谱），并生成每一种组分对应的abundance map（丰度图）。

图：从拉曼数据采集到端元解混的完整流程示意图

       为了验证算法的可靠性，团队将同一类器官切片先做拉曼成像，再做免疫荧光染色，然后将深度学习重建的分子丰度图与荧光图像进行逐像素比对。拉曼成像在切片上进行（像素尺寸2 μm），随后对同一区域进行DAPI（细胞核）和DiO（细胞膜）染色。

       结果显示，深度学习重建的核酸丰度与DAPI信号、脂质丰度与DiO信号高度吻合。尤其是神经类器官中标志性的神经花环结构，其顶端膜区被拉曼成像勾勒得清清楚楚，位置和形态几乎与荧光照片一模一样。

图：深度学习增强拉曼成像（右）与荧光显微镜（左）的对比验证

四、完整类器官成像与发育追踪

       在验证方法可靠性后，团队开始对完整类器官进行拉曼成像，团队将像素尺寸缩小至1 μm，对完整第10天神经类器官的400×346 μm区域进行精细扫描。结果显示，单个细胞核边界清晰可辨，细胞膜结构连续完整，散在的脂滴作为亮斑被显著标记。

图：完整类器官亚细胞分辨率成像

       本研究通过对完整Day 20神经类器官进行Z-stack拉曼扫描，利用脂质、蛋白质和核酸等endmembers的空间分布，在无需切片和外源标记的情况下重建了细胞及神经玫瑰的三维结构；同时，研究还观察到与细胞色素c相关的拉曼信号，其定位主要位于细胞核周围的胞质区域，与线粒体分布具有一定一致性。不过，作者强调，这些结构的生物学身份仍属于基于拉曼信号的推断，需要结合传统成像方法进一步验证。

图：代表性Z层对应的丰度分布图（D）；不同深度处所选端元成分的图像重建结果（E）

       研究的最后一个重要部分，是时间点分析。团队选取神经类器官培养的五个关键节点：第5、10、20、30、40天——采集了来自3个独立培养批次的72张拉曼扫描图，系统追踪生化成分随发育时间的变化。

图：时间点研究示意图

结果清晰显示了类器官从“野蛮生长”到“有序成熟”的分子历程：

第5天（干细胞主导期）：各组分信号相对均一，以核酸和蛋白质为主，对应未分化状态。

第5-10天（神经祖细胞增殖期）：核酸信号攀升至峰值，对应祖细胞大量增殖、DNA复制活跃。

第20天及以后（神经元分化与成熟期）：脂质信号开始显著爬升，恰好对应神经突起生长、突触形成和膜结构大幅增加；部分蛋白在特定区域出现空间特异性分布。

图：五个时间点组中选定类器官样本的丰度重建图（白色箭头：神经玫瑰结构）

       这一分析全程未使用任何抗体或标记物，仅凭拉曼光谱的分子指纹特征就完成了类器官发育轨迹的描画。

五、结语

       本研究成功构建了一种基于拉曼显微光谱与深度学习自编码器的无标记成像平台，并在神经类器官体系中系统验证了其可行性与优越性。该平台能够在无需外源标记和复杂样品制备的条件下，实现完整类器官的二维及三维生化成像，空间分辨率达到亚细胞水平。通过与免疫荧光染色这一金标准技术的逐像素比对，研究证实了该方法在核酸与脂质空间分布重建上的准确性和鲁棒性。

       基于该平台，研究进一步揭示了神经类器官在早期发育阶段脂质、蛋白质和核酸三大类生物分子的时序变化规律，展示了该技术在动态发育研究中的实用价值。该方法突破了传统成像技术在多重检测能力和标记依赖性方面的固有局限，为类器官研究提供了一种非侵入式、高内容化的生化表型分析新工具。

       尽管当前自发拉曼成像在速度上仍受物理原理制约，且深层组织信号衰减和端元光谱归属模糊性问题有待进一步优化，但该框架与快速相干拉曼散射技术具有良好的兼容性，具备向高通量动态成像拓展的潜力。总体而言，这项研究为无标记生化成像在复杂三维生物体系中的应用建立了技术范式，也为类器官发育、疾病模型和药物响应研究提供了新的分析维度。

参考文献&来源：

[1]Georgiev D, Xie R, Reumann D, et al. Label-free biochemical imaging and time point analysis of neural organoids via deep learning–enhanced Raman microspectroscopy. Science Advances. 2026;12:eaec5080.

[2]https://scbrm.bme.wisc.edu/neural-rosettes/

[3]Jiang, Chengshun et al. “Raman spectroscopy combined with multiple technologies for label-free identification of immune cells: An overview.” Journal of pharmaceutical analysis vol. 16,6 (2026): 101468. doi:10.1016/j.jpha.2025.101468

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