类器官（Organoids）是源自干细胞或肿瘤细胞的三维细胞培养模型，具备对应器官的细胞类型和空间结构，能模拟器官部分功能，在疾病研究、药物筛选和再生医学等领域具有重要应用。利用类器官病理研究，可在体外观察器官生长发育过程，替代传统动物模型，大幅缩短药物研发周期，降低研发成本，提升疾病治疗效率。通过类器官病理研究，科学家们能够更精准地探究疾病机理，加速新药筛选，减少动物实验依赖，推动个性化医疗发展。

类器官病理步骤参考：

一、类器官培养：

参考类器官培养技术试剂盒步骤

二、类器官固定：

1.将去除培养基和基质胶的类器官移至 1.5ml 的 EP 管中，加入 4%的多聚甲醛至接近 1.5ml。 

2.离心。配平后，离心机里离心 10min 左右。 

3.融化琼脂糖。离心期间，用水壶水浴加热 ep 管里的琼脂。 

4.离心沉淀后，用移液枪吸掉上清液，留下类器官沉淀物。 

5.往离心管里加入融化的琼脂，趁琼脂没凝固可以用镊子轻轻拨动细胞，让类器官尽量分布 

在琼脂中间。

6.放入 4℃°冰箱冷藏。 

7.取出用琼脂包埋好的类器官，放入 50%酒精和 75%各 4h 或过夜。 

三、包埋：

8.脱水：将包埋框放进脱水机吊篮里内依次用梯度酒精进行脱水。75%酒精 2h 85%酒精 

1h-90%酒精 1h-95%酒精 40min-无水乙醇 I 30min-无水乙醇 II 30min-醇苯 10min-二甲苯 I 

5min-二甲苯 II 5min-蜡 I 1h-蜡 II 1h-蜡 III 1h。 

9.包埋：将浸好蜡的类器官于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前 

将类器官从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋底模及包埋框。于-20°冻台冷却，蜡 

凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

四、切片：

切片厚度：根据实验需要选择适当的切片厚度（通常为3-5um）。

五、染色：

常规染色：如苏木精-伊红（H&E）染色，用于观察整体组织结构。

特殊染色：如PAS染色、Masson染色、铁染色等，用于特定组织成分的观察。

免疫组化染色：使用抗体检测特定蛋白的表达和定位。

附石蜡切片免疫荧光实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min- 

无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精 5min-75%酒精 5min-蒸馏水洗。 

2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液（PH9.0）抗原修复液的修复壶中于

进行抗原修复，95℃，25min。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却 

后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。 

3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液（双氧水：纯水=1:9），室温避光孵

育25 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。 

4、BSA 封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA 

均匀覆盖组织，室温封闭10min。 

5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒

内4°C 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 

6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。切片稍甩 

干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育1h。 

7、显色：孵育完成后PBS 冲洗掉残留二抗，切片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动

洗涤3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的荧光显色液，PBS 冲洗切片终止显色。 

8、DAPI 复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。 

切片稍甩干后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育 10min。 

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干 

后用抗荧光淬灭封片剂封片。

六、图像采集：切片于成像平台采集图像。

七、图像分析：通过图像分析软件进行定量分析和统计。