类器官——超越传统生物医学模型 - 上海晗澄生物科技有限公司

类器官模型是现有生物医学模型（细胞系、患者来源的原代细胞培养、动物模型、患者来源的异种移植模型、遗传操纵的动物模型）的显著改进。类器官模型重新定义了生物医学模型的格局，提出了一种更符合生理学的相关替代方案。与其他模型相比，类器官模型不仅具有更短的构建周期和更高的成功率，而且在保留患者个体化组织特征方面表现出色。

类器官简介及市场规模

类器官（Organoids）是指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。其与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能，因此也被称为“微型器官”。

根据细胞来源的不同，类器官可分为成体干细胞（Adult stem cell，ASC）、多能干细胞（Pluripotent stem cell，PSC）或肿瘤类器官（Patient-derived organoid，PDO）。其中，PSC又细分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）。

类器官拥有与来源组织一致的可自我更新的干细胞群，并且可通过使用含有特定细胞因子的培养基诱导这些干细胞扩增，从而实现类器官的稳定传代和持续培养。类器官包含多种细胞类型，能够更好地模拟人体内细胞间及细胞与基质间的相互作用，从形态结构到表观遗传学方面均能精准体现来源组织的特点，进而更加逼真地揭示人体内各种器官的生理病理机制。因此，类器官在基础研究和临床诊疗研究中展现出广阔的应用前景。

类器官行业发展历程

早在20世纪80年代，“organoid”一词就已提出，但直到2009年，HANS CLEVERS团队成功将成体干细胞培养出小肠的隐窝和绒毛结构，类器官研究才翻开快速发展的新篇章。2011年，日本RIKEN发育生物学中心利用胚胎干细胞培养出视杯结构。随后，各国研究团队相继构建出肝芽、迷你肾和微型大脑等结构。2013年，《科学》（Science）杂志将类器官技术列入“十大突破”技术之一。2014年，纪念斯隆凯特林癌症中心首次在实验室培养出人源前列腺肿瘤类器官。

随着类器官研究的不断深入，多种脏器类器官被成功构建，包括小肠、胃、结肠、肺、膀胱、大脑、肝脏、胰腺、肾脏、卵巢、食道、心脏等，涵盖正常器官组织和相应肿瘤组织类器官。在此基础上，研究人员开展了分子功能实验、药物筛选实验等，类器官在科研领域的作用日益凸显。

2018年2月23日，《科学》杂志发表了一项震惊世界的研究成果：在预测抗癌药物有效性和指导临床用药方面，类器官展现出卓越的预测性，与患者实际疗效相比，其敏感性达到100%，特异性为93%，阳性预测值为88%，阴性预测值高达100%。

不同种类类器官形貌图

（a）小肠类器官形貌图.（b）结肠类器官形貌图.（c）食管类器官形貌图.（d）胃类器官形貌图.（e）肝脏类器官形貌图.（f）胰腺类器官形貌图.（g）肺类器官形貌图.（h）乳腺类器官形貌图.（i）肾类器官形貌图.（j）脑类器官形貌图.

类器官发展历程

类器官模型与其他模型比较

特征/模型	类器官模型 (Organoids)	2D细胞培养 (2D Cell Culture)	动物模型 (Animal Models)	器官芯片 (Organ-on-a-Chip)
定义	来源于干细胞（多能干细胞或成体干细胞）的三维（3D）体外自组织微组织，再现体内器官的结构和功能复杂性。	细胞在平坦表面（如培养皿）上单层生长。	利用活体动物（如小鼠、大鼠、斑马鱼、非人灵长类）模拟人类生理和疾病。	微流体装置中培养细胞，模拟特定器官或组织的微环境和机械力（如流体剪切力、拉伸）。
生理相关性	高 - 高度模拟来源器官的细胞组成、空间结构、细胞间相互作用和部分功能。保留患者特异性特征（如源自患者样本时）。	低 - 缺乏体内组织的空间结构、细胞异质性和微环境。丧失许多生理功能。	高 - 代表完整的生物系统，包含器官间相互作用、免疫系统、循环系统等。	中-高 - 能精确控制细胞微环境和机械力，但通常缺乏完整的器官结构和体内复杂性（尤其在多器官集成前）。
复杂性/异质性	中-高 - 包含多种相关细胞类型，形成类器官结构层次。可再现一定的组织异质性。	低 - 通常单一或少量细胞类型，缺乏空间组织和异质性。	极高 - 包含所有细胞类型、组织层次、器官系统和系统性相互作用。	中 - 可整合多种细胞类型，但结构复杂性通常低于类器官或动物。重点在于微环境模拟。
可及性/通量	中 - 建立周期较长（数周至数月），但一旦建立可扩大培养和冻存。通量高于动物模型，但低于2D细胞系。可进行中通量筛选。	高 - 建立快（数天），操作简单，成本低，非常适合高通量药物筛选和遗传操作。	低 - 饲养成本高、周期长、伦理审查严格、通量低。遗传操作在小鼠中成熟但耗时。	中-高 - 微流控平台本身可小型化高通量，但细胞培养和芯片操作可能增加复杂性。通量潜力高。
成本	中 - 初始建立成本较高（培养基、因子），后续维持成本低于动物模型。	低 - 最经济实惠的模型。	高 - 动物购买、饲养、操作、伦理、设施成本都非常高。	中-高 - 芯片本身、微流控设备和细胞培养成本较高。
个性化潜力	极高 - 可直接从患者组织或iPSC建立，保留个体遗传背景和疾病特征。是个性化医疗的理想平台（药敏测试、疾病建模）。	中 - 可建立患者来源原代细胞培养，但传代有限且丧失组织特性快。	极低 - 通常使用近交系动物，遗传背景均一，难以直接反映个体差异。人源化小鼠成本高且复杂。	中-高 - 可整合患者来源细胞，实现一定程度的个性化模型。
应用领域	疾病建模：遗传病、癌症、感染性疾病等。	基础机制研究：信号通路、基因功能。	体内生理学研究：全身效应、代谢、行为等。	药物渗透/转运研究（如血脑屏障）。
	药物发现：药效、毒性评估（肝毒性、心脏毒性等）。	高通量药物初筛。	复杂疾病机制。	机械力对细胞功能影响。
	再生医学：组织修复、移植研究。	病毒培养。	药代动力学/毒理学（PK/PD/Tox）。	特定器官毒性评估。
	宿主-病原体相互作用。	细胞系稳定性测试。	安全性评价（法规要求）。	简化版器官间相互作用（多器官芯片）。
	个性化医疗：预测治疗反应。		外科技术开发。	血管化研究。
主要优势	高生理相关性（结构/功能）。	操作简单、标准化。	完整的生物系统（器官互作、免疫、循环等）。	精确控制微环境（生化/物理）。
	患者特异性建模潜力。	成本低廉、通量高。	体内微环境真实。	模拟动态力学生物学（流体、形变）。
	长期培养可行性。	易于遗传操作和显微观察。	复杂表型研究（行为、发育等）。	可集成传感器实时监测。
	比动物模型更符合伦理。	数据产出快。	法规认可度高（尤其毒理、安全）。	多组织接口模拟潜力。
	减少种间差异（人类细胞来源）。			降低动物使用量。
主要局限性	通常缺乏血管系统/免疫细胞（活跃研究领域）。	生理相关性差。	显著的种间差异（影响药物反应、毒性预测）。	结构复杂性通常低于类器官。
	批次间变异性。	丧失体内组织结构和异质性。	高成本、低通量、周期长。	芯片制造和操作复杂性。
	建立和标准化复杂。	异常的表型和信号通路激活（接触抑制丧失）。	复杂的伦理问题。	细胞来源和活力挑战。
	成熟度限制（常模拟胎儿/发育状态）。	有限的功能性输出。	结果解读可能复杂（动物背景干扰）。	成本相对较高。
	通量低于2D细胞。			标准化仍在发展中。
是否包含微血管	无（当前技术，是重大挑战）	无	是（天然）	可设计（通过内皮细胞共培养模拟）
是否包含免疫成分	无（或非常有限），需与免疫细胞共培养构建免疫类器官	无	是（完整的天然免疫系统）	可整合（通过加入免疫细胞）

类器官主要成分及构建

类器官培养系统主要包括基质胶、维持类器官生态所需因子和分化所需因子这几个主要元素。基质胶中含有胶原、巢蛋白和纤连蛋白等等，为类器官形成三维空间结构提供基质。维持类器官生态因子主要目的为促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡等。

肿瘤类器官 (Patient-derived organoid，PDO)常用的的3D培养体系，包含：类器官培养基、原代缓冲液、原代组织消化液、类器官消化液、组织保存液、类器官冻存液、传代缓冲液、基质胶等。

常用的类器官培养操作步骤（以人肺癌类器官培养为例）：

组分：肺癌类器官培养基A、原代缓冲液B、原代组织消化液C、类器官消化液 D、组织保存液E、类器官冻存液 F、传代缓冲液G 、低因子无酚红基质胶

1 组织前处理

1.1 实验材料

需提前准备原代缓冲液B（4 ℃预冷）、组织保存液E、取样管、组织运输箱、冰袋。

1.2 组织的获取与运输

组织的取样与运输是类器官构建成功的第一个环节也是最容易忽视的环节，若组织前期保存不当会导致细胞活性差、污染、有效细胞少等问题，降低类器官构建成功率。

组织应在离体的30 min内放入组织保存液E，原代缓冲液B清洗3-5次，将组织表面血液冲洗干净，放入组织保存液E中，取样管于4 ℃低温保存运输（72 h内）。

2 类器官原代培养（以24孔板为例）

2.1 实验材料

需提前准备原代缓冲液B（4 ℃）、原代组织消化液C（37 ℃）、基质胶（提前24 h放入4 ℃冰箱融化）、肺癌类器官培养基A（室温或37 ℃）、镊子（10㎝）、尖头眼科手术剪/手术刀片、一次性60 mm培养皿、1.5 mL/15 mL/50 mL离心管、100㎛细胞滤网、3 mL巴氏吸管/1000 ul移液枪、24孔细胞培养板、金属冰盒，水浴锅。

2.2 肺癌类器官构建

2.2.1 组织的处理

取材后的肺癌组织建议在 2 – 8 ℃条件下保存运输，快速转运至洁净实验室进行肺癌类器官构建实验流程，组织拍照并登记详细信息。

2.2.1.1 组织的清洗

取样管消毒后，在超净台中将组织取出来，放入培养皿中，加入原代缓冲液 B，用3 mL巴氏吸管或1000 ul移液枪吹打清洗，重复清洗操作三次及以上。

2.2.1.2 组织的解离与消化

用眼科剪或手术刀片去除组织杂质，镊子转移至1.5 mL EP管中，用眼科剪进一步将组织机械解离成体积约为 1~3 mm³的组织块，转移至15 mL EP管中，加入5 mL原代组织消化液37 ℃震荡消化15-25 min。消化过程每10 min显微镜下观察组织消化情况，取少量消化液在显微镜下观察，观察到较多的70 μm以下的细胞簇或单个细胞后进行下一步操作。组织消化程度见图一。

若组织量太少或活检组织用1 mL原代组织消化液C在1.5 mL EP管消化。

图一癌组织消化成较多细胞簇或较多单细胞

2.2.1.3 组织的过滤

消化完成后，组织涡旋仪涡旋10秒，加入3倍体积的原代缓冲液B终止消化，消化组织混合液通过100 μm孔径的细胞筛网过滤，继续用10-20ml原代缓冲液B漂洗组织，达到收集更多组织团块细胞，300 g富集离心5 min后弃上清；用8-10ml原代缓冲液B重悬离心沉淀（去除更多杂质），300 g富集离心5 min后弃上清。

若细胞沉淀含有红细胞，加入1-2 mL红细胞裂解液1-2 min后，稀释至10 mL，300 g富集离心5 min后弃上清。沉淀过少或无红细胞时直接进行类器官培养。

2.2.1.4 肿瘤类器官培养

观察离心收集的细胞沉淀体积量，添加25倍体积的基质胶重悬，形成3D培养空间结构，重悬过程中避免产生气泡。细胞沉淀体积量见图二，按照如图细胞沉淀量分别加入300 ul、250ul、150 ul、100 ul基质胶。

图二细胞沉淀体积量

24孔细胞培养板按照25 ul-30 ul/孔点胶，基质胶全程维持在0-4 ℃条件下操作。细胞培养板放置37 ℃培养箱中10-15 min，待基质胶凝固后，24孔细胞培养板每孔添加750μl肺癌类器官培养基A（室温）放置37 ℃培养箱培养。

3 类器官传代培养（以24孔板为例）

3.1 实验材料

传代缓冲液G（4 ℃）、类器官消化液D（室温或37 ℃）、基质胶（提前24 h放入4 ℃冰箱融化）、肺癌类器官培养基A（室温或37 ℃）、1.5 mL/15 mL离心管、24孔细胞培养板、冰盒。

3.2 类器官传代

选择合适的类器官进行传代，一般为生长一周左右，显微镜10X下可看到超过20个的类器官，或大小100-200μm的类器官。

吸掉培养基，每孔添加等体积的传代缓冲液G，移液枪轻柔吹散基质胶，收集于15 mL离心管中，每6-8孔转移至一个离心管，4 ℃静置10-15 min。

3.2.1 类器官消化

根据类器官的生长情况来决定是否需要消化传代。离心后若管底沉淀少、未见细胞、基质胶未分层等情况，可再次重悬，提高离心力，再次离心。

当类器官数量不足或体积较小时，300 g离心5 min弃上清。

当类器官数量较多或体积较大时，300 g离心5 min弃上清，可选择消化液消化或机械消化。

消化液消化：加入1-2 mL类器官消化液D，将细胞沉淀吹散后，室温消化2-3min，每隔一分钟吹打一次，每次吹打20下，显微镜下观察，直至消化至（图三A-B）状态时即可停止。添加3倍类器官消化液体积的传代缓冲液G终止消化，300 g离心5 min，弃上清。

3.2.2 传代类器官培养

观察离心收集的类器官沉淀体积量，若沉淀很少可预留1倍沉淀体积的上清液点胶，沉淀很多上清可吸净，添加25倍类器官沉淀体积的基质胶量重悬类器官。基质胶体积量可参考“类器官原代培养操作图二”。

4 类器官冻存（以24孔板为例）

4.1 实验材料

传代缓冲液G（4 ℃）、类器官冻存液F（4 ℃）、15 mL离心管、细胞冻存管、程序降温盒、移液枪。

4.2 类器官冻存

暂不使用的类器官应冻存，放于低温环境保存。

吸掉培养基，每孔添加等体积的传代缓冲液G，移液枪轻柔吹散基质胶，收集于15 mL离心管中，每6-8孔转移至一个离心管，4 ℃静置10-15 min。300 g离心5 min弃上清，每三个孔加入2 mL类器官冻存液F，轻柔吹打混匀，转至细胞冻存管中，每管1 mL。

做好标记信息，放入程序降温盒中，移至-80 ℃冰箱中，48 h后，放入液氮罐中保存。或放入4 ℃冰箱40 min后，放入-20 ℃冰箱中2 h，移至-80 ℃冰箱中，48 h后，放入液氮罐中保存。

5 类器官复苏培养（以24孔板为例）

5.1 实验材料

传代缓冲液G、肺癌类器官培养基A、基质胶（提前24 h放入4 ℃冰箱融化）、24孔细胞培养板、冰盒、15mL离心管、水浴锅、3mL巴氏吸管/移液枪。

5.2 类器官复苏培养

从低温环境中取出冻存的类器官，快速置于37 ℃水浴锅中融解，水浴融解过程中，需轻轻摇动冻存管，以确保冻存液在短时间内完全融解。将解冻后的类器官快速转移至15 mL离心管，使用移液枪轻柔吹打6-8次，300 g 离心5 min弃上清；添加适量传代缓冲液G重悬，移入1.5 mL离心管300 g离心5 min，弃上清。