操作流程示意图：
操作步骤：
1、 冰冻切片准备：冰箱取出冰冻切片恢复至室温晾干水分后固定10-30min，PBS洗5min重复3次。
2、 切片破膜：滴加破膜液通透20min，PBS洗5min重复3次。（此步骤适用于胞内指标，若不是胞内指标可以跳过此步骤）
3、 抗原修复：切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中60度水浴30min，自然冷却，PBS洗5min重复3次（此步骤可选做，修复有助于暴露抗原和去除内源性过氧化物酶）。
4、 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
5、 BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3% BSA（或者其他封闭液）均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
7、 加HRP二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS洗三次，每次5分钟。
8、 荧光染料反应：浓缩型荧光染料与TSA buffer按照1:50- 1:200的比例混合均匀，切片滴加配好的TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应1- 15min（最佳时间5min- 10min），PBS洗三次（预实验可先染1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步）反应2-15min，PBS洗三次。
9、 上一轮抗体洗脱：滴加适量37度预热至完全溶解的抗体洗脱液覆盖样本，37度放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37度放置5-20分钟，弃洗脱液，PBS洗三次，每次5分钟。
10、重复4-9步骤（换用另外一种荧光染料）---第二轮标记
11、重复4-8步骤（换用另外一种荧光染料）---第三轮标记
…………………………………………… ---第N轮标记
12、DAPI染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
13、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
14、镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
参考结果：
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试剂盒产品清单：
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