原理介绍：

    TSA多重荧光免疫组化（Tyramide Signal Amplification multiplex fluorescent Immunohistochemistry）是一种基于酪胺信号放大技术的高重数、高灵敏度的原位蛋白检测方法。酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化非活性荧光素。荧光素在 HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟邻近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制 。

TSA技术利用辣根过氧化物酶（HRP）催化标记了荧光染料的酪胺（Tyramide）底物，在抗原-抗体结合位点局部产生大量荧光信号沉积，实现信号级联放大（通常可放大10-100倍）。

主要用于组织、石蜡切片、TMA芯片的免疫组化染色。也可用于冰冻切片和细胞爬片组化染色。

试剂盒保存：4℃，有效期12个月。

试剂盒组分: TSA染料、TSA染料稀释液、HRP标记二抗、DAPI染液（即用型）、抗体稀释/封闭液、3%过氧化氢、抗荧光淬灭封片剂，具体组份量请参考各试剂盒说明书。

使用方法：

样本要求：

1. 福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。
2. 玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。
3. 组织最小应包含大于1000个细胞。
4. 蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。
5. 组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18-24h。
6. 切片厚度为4um左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。
7. 不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片。
8. 玻片置于45°C热盘上放置30min(自然风干玻片时长不小于1h)。

检验方法：

1. 所需仪器设备:移液器、恒温干燥箱、微波炉、免疫组化笔、修复杯、染色缸、计时器、孵育湿盒、盖玻片、通风橱、洗瓶、荧光显微镜、量筒100ml、量筒1000ml等。
2. 所需试剂:灭菌去离子水、二甲苯、乙醇(100%、95%、85%、75%)、抗原修复液、一抗等。

试剂准备:

1. 荧光染料工作液配制方法：TSA染料稀释液按照1:200-1:400比例稀释（建议1:400开始）。
2. 一抗：参考一抗说明书稀释，准备对应的抗原修复液。

检测设备：

荧光显微镜或荧光全片扫描设备，TSA单色荧光染料适用的激发和发射滤光片应符合表中的建议。

 石蜡切片样本操作步骤示例： 

1，样本准备:

       石蜡切片：依次将切片放入二甲苯I（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→无水乙醇（5min）→无水乙醇（5min）→95%乙醇（5min）→85%乙醇（5min）→75%乙醇（5min） ，ddH2O，3次，每次5min。

2，抗原修复:

选择修复液：  □ Tris-EDTA（pH 9.0） □ 柠檬酸（pH 6.0）(参考一抗说明书选择）

选择修复方式：□ 煮沸法修复：100℃煮沸后，调整温度到95℃，插入切片，修复25分钟 （优先推荐）

           □ 微波炉高火4min，插入切片，中低火修复6min，关火静置5min （参考功率：格兰仕700W）

注意：微波修复时间视微波炉功率调整，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片自然冷却后将玻片置于1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min，重复3次。

           甩干切片上面水渍，用组画笔，画出阻水圈，阻水圈位置离组织约2-3mm。

3，阻断内源性过氧化物酶: 切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，将玻片置于1*PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4，非特异性靶点封闭: 切片稍甩干后在圈内滴加用抗体稀释/封闭液均匀覆盖组织，室温封闭30min。

5，加一抗:  轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释/封闭液稀释好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37°C 1-2h（根据经验决定一抗浓度及孵育时间）；将玻片置于1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min，重复3次。

6，加HRP二抗: 切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育1h，1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。

7，​​​​​​​TSA荧光染料反应: 滴加TSA染料工作液均匀覆盖组织室温反应5min，（如有条件可先荧光显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步）。1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。

8，​​​​​​​抗体洗脱: 抗原修复液100℃煮沸后，调整温度到95℃，插入切片，水浴25-40min（根据不同抗体亲和力灵活调整时间），1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。

9，​​​​​​​​​​​​​​重复4-8步骤，换用下一轮TSA染料进行第二个指标标记直至最后一个指标完成TSA染料标记

         注意：最后一轮标记可以不用做抗体洗脱步骤。

10，​​​​​​​DAPI复染细胞核:  切片稍甩干后在圈内滴加DAPI 即用型染液，避光室温孵育5min。1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。

11，封片: 切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

12，成像: 切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

冰冻/细胞样本操作步骤示例：

​​​​​​​1，样本准备:

        冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。

        细胞爬片或者细胞涂片：细胞爬片或者细胞涂片固定10-20min，1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次​​​​​​​。

2，抗原修复（冰冻切片样本可选，细胞爬片/涂片样本不需要做）：

      冰冻切片可以不进行抗原修复，染色效果欠佳时，可以考虑尝试进行抗原修复，推荐冰冻切片专用抗原修复液。

3，​​​​​​​阻断内源性过氧化物酶: 甩干切片上面水渍，用组画笔，画出阻水圈，阻水圈位置离组织约2-3mm。滴加3%双氧水去除内源性过氧化物酶 ，室温10~30min。1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min，重复2次。​​​​​​​

4，通透打孔：滴加0.3%triton-X100破膜液通透20min ，1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。样本通透性的处理请根据以往经验操作。

5，特异性靶点封闭：切片稍甩干后在圈内滴加用抗体稀释/封闭液均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6，加一抗: 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释/封闭液稀释好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37°C 1-2h（根据经验决定一抗浓度及孵育时间）；将玻片置于1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min，重复3次。

7，加HRP二抗: 切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育1h，1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。

8，TSA荧光染料反应: 滴加TSA染料工作液均匀覆盖组织室温反应5min，（如有条件可先荧光显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步）。

        1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min ，重复3次。​​​​​​​

9，抗体洗脱: 洗脱缓冲液（冰冻/细胞） 37℃孵育15-20min。

洗脱效果取决于切片厚度、洗脱温度和时间、 一抗种类（洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白 > 胞浆蛋白 > 胞核蛋白）。如果某些抗体的洗脱有问题，请降低一抗稀释比例，或将这个靶点放到最后一轮做。1*PBS,5min，洗2次。

​​​​​​​10，重复5-9步骤，换用下一轮TSA染料进行第二个指标标记直至最后一个指标完成TSA染料标记，

      注意：最后一轮标记可以不用做抗体洗脱步骤。

11，​​​​​​​DAPI复染细胞核: 切片稍甩干后在圈内滴加DAPI即用型染液，避光室温孵育5min。1*PBS中在脱色摇床上晃动洗5min，重复3次。

12，封片: 切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

13，成像: 切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

染料信息表格：

常规免疫荧光染色步骤请参考：免疫荧光染色操作步骤（组织篇）

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晗澄生物mIHC试剂盒信息：

更多试剂盒请参考：https://www.neorise.cn/products/524/

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