一、实验前准备

样本：石蜡切片、冰冻切片或细胞爬片/涂片。

试剂：一抗：针对目标蛋白的特异性抗体。

荧光标记二抗：常用 Alexa Fluor 488（绿色）、Cy3/Alexa Fluor 594（红色）、DAPI（蓝色核染料）等。

*NOTES：二抗与一抗种属匹配（如抗兔、抗鼠等）。

封闭液：3% BSA 或封闭液（如 10%正常山羊血清）/PBS。

抗体稀释液：通常使用封闭液或专用抗体稀释缓冲液。

通透液：0.1-0.5% Triton X-100/PBS（用于胞内抗原，根据样本选择）。

封片剂：抗荧光淬灭封片剂。

缓冲液：1*PBS，pH 7.4。

设备与耗材：湿盒、移液器、避光湿盒、盖玻片、荧光显微镜。

二、操作步骤（以石蜡切片为例,其他样本步骤略有不同）

样本准备与脱蜡水化

1. 烤片：将石蜡切片置于65℃烘箱中烘烤2小时及以上，使组织紧密贴附（60℃烘烤4小时）
2. 脱蜡复水：二甲苯 I（10min）→二甲苯 II（10min）→无水乙醇（5min）→无水乙醇（5min）→95%乙醇（5min）→85%乙醇（5min）→75%乙醇（5min）
3. 用 1*PBS 润洗 3 次，每次 5min。

抗原修复（对于大多数石蜡切片样本必需，以恢复抗原表位）

热修复（推荐）：

4. 选择修复液：Tris-EDTA（pH 9.0）□  or  柠檬酸（pH 6.0）□
5. 选择修复方式： 恒温水浴 95℃，25min 

 微波炉高火 4min，插入切片，中低火修复 6min，关火静置5min 

6. 自然冷却至室温（约 30-60 分钟，可开盖用电风扇加速降温）
7. 用 1*PBS 润洗 3 次，每次 5min。

免疫染色

8. 擦去切片上面水渍，用组画笔，画出阻水圈，阻水圈位置离组织约 2-3mm
9. 阻断内源性过氧化物酶：滴加 3%双氧水 or 3%过氧化氢，室温避光 15min
10. 用 1*PBS 润洗 3 次，每次 5min
11. 甩掉阻断液，滴加抗体稀释液/封闭液/3%BSA in pbs，室温避光 30min
12. Panel 设计（如有）

    13. 吸弃封闭液，勿干片，滴加用抗体稀释液稀释好的一抗，确保完全覆盖组织

    14.将切片放入 4℃湿盒中过夜孵育（12-16 小时），次日拿出恢复室温，15-30min 可获得最佳信噪比；也可 37℃孵育 1-2 小时（效果可能稍差），

    15. 1*PBS，润洗 3 次，每次 5min，洗去未结合的一抗

    16. 滴加与一抗种属匹配的荧光标记二抗（用抗体稀释液按说明书推荐比例1：100稀释），室温避光湿盒中孵育1-2小时

    17. 1*PBS，润洗 3 次，每次 5min

   18. 滴加 DAPI 工作液（按说明书使用），室温避光孵育 5-10min

   19. 用 1*PBS 避光漂洗 3 次，每次 5min，洗去多余 DAPI

   20. 用吸水纸吸去周围液体，滴加抗荧光淬灭封片剂，轻轻盖上盖玻片，避免气泡。

*Notes：染色全程需避光，切勿干片

三、结果观察

   21.将切片置于荧光显微镜下观察，使用对应波长的激发光和滤光片观察不同荧光信号。

  *Notes：尽快拍照（最好在 24 小时内），以防荧光淬灭。

四、关键注意事项与技巧

全程防干：从加一抗开始，组织区域在任何步骤中都不能干燥，否则会导致高背景和非特异性染色。严格避光：从加二抗开始，所有步骤都应在避光条件下进行，以防荧光淬灭。

设立对照： 阴性对照：用 PBS 或无关 IgG 代替一抗，用于评估背景和非特异性结合。

阳性对照：已知表达目标蛋白的样本，用于验证实验体系有效。

空白对照：不加一抗和二抗，用于评估自发荧光。

抗体优化：一抗的浓度和孵育时间是关键，需根据抗体说明书和预实验进行优化。

减少非特异性：

使用合适的封闭血清（与二抗同源）。

在洗涤液中加入 0.05%-0.1%的 Tween-20 可减少非特异性吸附。

样本特异性：

细胞爬片：通常需要 0.1-0.5% Triton X-100 进行透膜处理（固定后、封闭前），固定常用4%多聚甲醛。冰冻切片：无需抗原修复，但需注意保存和固定条件。

五、 常见问题与优化建议

多重荧光免疫组化染色步骤请参考：晗澄生物TSA多重荧光染色试剂盒操作步骤

晗澄生物荧光二抗：

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