肺作为呼吸系统的核心器官，其主要功能是完成气体交换，同时参与免疫防御、炎症反应及代谢调控。从组织学角度来看，肺结构具有高度的空间异质性：从传导气道到终末肺泡，各区域在细胞组成、基质结构及功能上均存在显著差异。因此，在进行组织学取材、切片及染色时，是否能够准确覆盖关键结构（如支气管、血管及肺泡区），将直接影响后续形态学判断及分子标志物分析的可靠性。本篇将从结构认知、取材策略、常用染色方法及免疫标志物应用四个方面，系统梳理肺组织的组织学处理要点。

图：人&小鼠肺部的解剖结构差异

 

一、肺组织结构概览

       从组织学角度看，肺组织主要由气道系统、肺泡结构及血管系统构成，其基本功能单位为肺泡（alveolus）。空气经支气管进入肺后，逐级分支形成细支气管，最终进入肺泡管和肺泡囊。肺泡由单层上皮细胞构成，周围密布毛细血管，是气体交换的主要场所。肺组织整体呈现出“气腔+薄壁+丰富血供”的典型特征。

1、气道系统（Airway）

气道系统包括支气管（bronchus）及细支气管（bronchioles），是空气进入肺泡的通道。

图：支气管周围可见软骨与平滑肌

图：细支气管周围可见平滑肌、纤毛，无软骨

结构特点：

🟢支气管

     ‣ 假复层纤毛柱状上皮

     ‣ 含杯状细胞（分泌黏液）

     ‣ 管壁可见软骨（Cartilage）及平滑肌（smooth muscle）

🟢细支气管

     ‣ 单层柱状或立方上皮（纤毛-黏液）

     ‣ 无软骨结构

     ‣ 平滑肌相对明显

功能特点：

     ‣ 空气传导

     ‣ 黏液分泌与清除颗粒物

     ‣ 局部免疫防御

在HE染色中，气道结构（尤其带软骨的支气管）是往往是我们识别肺组织的重要标志。

2、肺泡结构（Alveoli）

肺泡是肺的基本功能单位，是气体交换的核心区域。

  

图：肺泡主要细胞组成

主要细胞组成包括：

     ‣ I型肺泡上皮细胞（Type I pneumocytes）：细胞扁平，覆盖绝大多数肺泡表面，负责气体交换

     ‣ II型肺泡上皮细胞（Type II pneumocytes）：立方形，分泌表面活性物质，具有再生潜能

     ‣ 肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages）：位于肺泡腔内，吞噬颗粒物与病原体

结构特点：

     ‣ 肺泡壁极薄

     ‣ 与毛细血管（Capillary）紧密贴近（气血屏障）

功能特点：

     ‣ 气体交换

     ‣ 表面活性物质分泌

     ‣ 局部免疫防御

HE下表现为大量“空腔样结构”，肺泡间隔薄而连续，病变时可见间隔增厚或结构破坏。

3、血管与间质结构

图：肺部血管与毛细血管

主要结构组成：

     ‣ 肺动脉/静脉

     ‣ 毛细血管网络

     ‣ 间质成分（胶原、弹性纤维）

功能：

     ‣ 气体运输

     ‣ 结构支撑

     ‣ 炎症与纤维化发生基础

 

二、肺组织切面选择（以小鼠为例）

小鼠肺组织具有典型的分叶结构（左1叶、右4叶），不同取材方式会直接影响组织代表性、结构完整性以及后续分析的可靠性。

   

图：小鼠肺结构

在实际工作中，常见有三种取材与包埋策略：

1、全肺包埋（Whole lung embedding）——一般也只适用于小鼠肺

方法：先整理好肺的形态，肺的底面贴模底进行包埋，该面也是切面。

 

优点：

     ‣ 最大程度保留肺组织整体结构

     ‣ 可同时观察：气道分布、血管走向、肺泡结构

缺点：

     ‣ 切片面积大，操作难度高

     ‣ 不同区域容易厚度不均，影响染色一致性

2、整叶包埋（Single lobe embedding）

方法：选择肺的一叶（常用左肺叶），最大面贴模底进行包埋，如果遇到不平整的组织，可以用海绵衬垫压平确保能够切到整个肺叶。

 

优点：

     ‣ 结构相对完整

     ‣ 取材标准化程度高（重复性好）

     ‣ 切片质量稳定

缺点：

     ‣ 代表性有限（不能完全反映全肺情况）

     ‣ 可能遗漏局灶性病变

3、局部横切包埋（Partial transverse section）

方法：在某一肺叶中选取代表性区域，进行横断切取，选择一侧切片贴模底进行包埋。需要注意的是，因为肺组织较软，下刀的时候手法要利落，刀要足够锋利，否则容易导致切面不齐，损坏组织，影响后续切片观察。

 

优点：

     ‣ 可精准选择病变区域

     ‣ 节约样本与试剂

缺点：

     ‣ 空间信息丢失

     ‣ 易产生选择偏倚（selection bias）

 

🎯Small Tips：

肺组织因充满空气且毛细血管丰富，我们在实际取材时会发现，如果直接取了放固定液里，会漂浮在固定液上面，导致固定不充分，最后的切片上呈现出来肺泡结构塌陷，看起来很致密，容易误判为肺纤维化，且红细胞非常多，做染色时非常影响观察。

最优解决方案——血管灌流+气管灌注：从小鼠心脏的右心室或左心室注射PBS，直到肺由红变发白或者发粉，减少红细胞背景；暴露气管后插针（或留置针），缓慢注入4%PFA，以肺叶刚刚膨胀展开恢复自然形态为最佳，避免过度膨胀呈气球状，肺泡扩张过度也会导致结构失真；将肺连同气管一起放入固定液进行固定，小鼠一般固定12-24h

图：血液灌流与否HE差异对比

图：气管灌注与否、过度灌注HE差异对比

若实验条件有限，不做心脏灌流，也尽可能保证做一下气管灌注，保证肺组织形态；若实在没有条件，要直接取材，可用滤纸轻压使组织下沉在固定液中，或用纱布包裹后再浸入固定液，并且要放入足够多的固定液，避免固定不彻底。

 

三、常用组织化学与特殊染色及其应用

1、HE染色（Hematoxylin & Eosin）

图：Noh, Soohwan et al.

染色特征：

     ‣ 细胞核：蓝紫色

     ‣ 细胞质：粉红色

     ‣ 红细胞：鲜红色（无核，强嗜酸性）

     ‣ 胶原纤维：淡粉色

在肺组织中的典型表现：

     ‣ 肺泡：大量“空腔样结构”

     ‣ 肺泡间隔：细薄、连续

     ‣ 气道上皮：排列整齐，纤毛可见（条件好时）

主要应用：

     ‣ 判断炎症浸润（中性粒/淋巴细胞）

     ‣ 观察肺泡塌陷或扩张

     ‣ 出血（红细胞在肺泡腔内聚集）

     ‣ 判断肿瘤形态

2、Masson三色染色

图：Mohi El-Din, Mouchira M et al.

染色特征：

     ‣ 胶原纤维：蓝色或绿色（取决于试剂体系）

     ‣ 细胞质/肌肉：红色

     ‣ 细胞核：深色（黑/蓝）

肺组织表现：

     ‣ 正常肺：间质胶原较少，仅肺泡间隔轻微染色

     ‣ 纤维化肺：间质明显增厚，蓝色胶原沉积增加

主要应用：

     ‣ 通过ECM（细胞外基质）沉积情况判断肺纤维化程度

3、EVG染色（Elastic Van Gieson）

图：Tsuchiya, Tomoshi et al.

染色特征：

     ‣ 弹性纤维：黑色或深紫色

     ‣ 胶原纤维：红色

肺组织表现：

     ‣ 正常：肺泡壁及血管壁可见细而连续的弹性纤维

     ‣ 病变：弹性纤维断裂（如肺气肿）、重构或增生

主要应用：

     ‣ 观察肺气肿

     ‣ 观察血管结构改变

4、PAS染色（Periodic Acid-Schiff）

图：Yoon, Sun-Young et al.

染色特征：

     ‣ 糖原/糖蛋白（如黏液）：紫红色或洋红色

     ‣ 细胞核：蓝色

肺组织表现：

     ‣ 杯状细胞：胞质内紫红色颗粒

     ‣ 黏液分泌：气道腔内可见阳性物质

主要应用：

     ‣ 观察黏液分泌异常（哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD））

     ‣ 杯状细胞增生

     ‣ 上皮分泌功能状态

5、天狼星红染色（Sirius Red）

图：Lei, Zelin et al.

染色特征：

     ‣ 胶原纤维：红色

     ‣ 在偏振光下：I型胶原：橙红/黄色；III型胶原：绿色

肺组织表现：

     ‣ 正常：胶原较少

     ‣ 纤维化：大量红色沉积，分布于肺泡间隔及间质

主要应用：

     ‣ 胶原沉积量（可定量）

     ‣ ECM组成变化

     ‣ 纤维化分级

 

四、肺组织常用免疫学标志物与应用方向

1、肺炎

病理本质：急性或慢性炎症反应，以免疫细胞浸润为主。

Marker	主要定位	应用
CD45	所有白细胞（膜）	评估整体炎症细胞浸润程度
CD68	巨噬细胞（胞质）	观察吞噬细胞反应
Ly6G	中性粒细胞（膜）	判断急性炎症（细菌感染常见）
CD3/CD4/CD8	T细胞（膜）	分析适应性免疫反应
MPO	中性粒细胞颗粒（胞质）	判断中性粒细胞活化
IL-6/TNF-α	炎症因子（胞质/分泌）	炎症强度与活化状态

2、肺结核

病理本质：以肉芽肿形成为特征的慢性炎症（Th1免疫主导）。

Marker	主要定位	应用
CD68	巨噬细胞（胞质）	肉芽肿核心细胞
CD163	M2型巨噬细胞（膜）	巨噬细胞极化状态
CD3/CD4/CD8	T细胞（膜）	分析免疫细胞构成
IFN-γ	T细胞分泌（胞质）	Th1免疫反应强度
Ki67	细胞核	判断增殖区域（活跃区）

3、尘肺

病理本质：粉尘沉积引发慢性炎症，继而诱导纤维化。

Marker	主要定位	应用
CD68	巨噬细胞（胞质）	吞噬粉尘颗粒
TNF-α	炎症因子（胞质）	炎症驱动机制
α-SMA	肌成纤维细胞（胞质）	成纤维细胞活化
Collagen I/III	细胞外基质（间质）	胶原沉积评估
TGF-β	胞质/分泌	纤维化关键通路

4、肺纤维化（如特发性肺纤维化（IPF））

病理本质：异常修复过程导致成纤维细胞持续活化及ECM沉积。

Marker	主要定位	应用
α-SMA	肌成纤维细胞（胞质）	纤维化核心细胞
Vimentin	间质细胞（胞质）	间质细胞总体分布
Fibronectin	ECM（间质）	基质重塑
Collagen I/III	ECM（间质）	胶原沉积程度
TGF-β	胞质/分泌	纤维化驱动通路
p-Smad2/3	细胞核	TGF-β通路活化状态

5、肺癌

病理本质：上皮细胞恶性转化，并伴随肿瘤微环境（TME）重塑

Marker	主要定位	应用
Pan-CK	上皮细胞（胞质）	肿瘤细胞识别
TTF-1	细胞核	肺腺癌标志
P63/P40	细胞核	鳞癌标志
Ki67	细胞核	增殖活性评估
CD31	血管内皮（膜）	血管生成分析
α-SMA	成纤维细胞（胞质）	CAF（肿瘤相关成纤维细胞）
CD8	T细胞（膜）	细胞毒性免疫反应
CD68/CD163	巨噬细胞（胞质/膜）	免疫抑制环境分析
PD-L1	细胞膜	免疫治疗靶点

 

 

参考文献&资料：

[1]Zhang, Jianguo et al. “Translational medicine for acute lung injury.” Journal of translational medicine vol. 22,1 25. 5 Jan. 2024, doi:10.1186/s12967-023-04828-7

[2]https://medcell.org/tbl/histology_of_the_respiratory_system/reading.php

[3]https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php?title=File:Respiratory_histology_08.jpg

[4]Sato, Susumu et al. “Scale dependence of structure-function relationship in the emphysematous mouse lung.” Frontiers in physiology vol. 6 146. 12 May. 2015, doi:10.3389/fphys.2015.00146

[5]Li, Chunyan et al. “Quantifying Pulmonary Microvascular Density in Mice Across Lobules.” Journal of visualized experiments : JoVE ,215 10.3791/66681. 3 Jan. 2025, doi:10.3791/66681

[6]https://www.feinberg.northwestern.edu/sites/mhpl/docs/resources/lung-perfusion-and-fixation.pdf

[7]Noh, Soohwan et al. “Neutrophilic Lung Inflammation Suppressed by Picroside II Is Associated with TGF-β Signaling.” Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM vol. 2015 (2015): 897272. doi:10.1155/2015/897272

[8]Mohi El-Din, Mouchira M et al. “Impact of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on remodeling the lung injury induced by lipopolysaccharides in mice.” Future science OA vol. 3,1 FSO162. 17 Jan. 2017, doi:10.4155/fsoa-2016-0036

[9]Tsuchiya, Tomoshi et al. “Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization.” Tissue engineering. Part C, Methods vol. 20,12 (2014): 1028-36. doi:10.1089/ten.TEC.2013.0492

[10]Yoon, Sun-Young et al. “S-adenosylmethionine reduces airway inflammation and fibrosis in a murine model of chronic severe asthma via suppression of oxidative stress.” Experimental & molecular medicine vol. 48,6 e236. 3 Jun. 2016, doi:10.1038/emm.2016.35

[11]Lei, Zelin et al. “Kisspeptin‑13 inhibits bleomycin‑induced pulmonary fibrosis through GPR54 in mice.” Molecular medicine reports vol. 20,2 (2019): 1049-1056. doi:10.3892/mmr.2019.10341

 

 

晗澄生物提供一站式mIHC多重免疫荧光解决方案，欢迎联系我们…

试剂盒产品链接：http://www.neorise.cn/products/454/

精选IHC一抗产品链接：https://www.neorise.cn/products/448/

上海晗澄生物科技有限公司

微信：15502157206

公众号：晗澄生物