QuPath的细胞检测以识别细胞核为核心：软件首先根据像素强度、纹理与形态特征定位和分割细胞核（避免核团粘连），随后再以核为中心向外推断细胞范围，从而建立每个细胞的独立计数单位。对于HE和IHC图像，检测主要依赖核形态和颜色吸光强度；而在荧光图像中，系统会根据荧光信号强度以辅助判定细胞轮廓及阳性表达。简而言之：先找到核→再确定阳性。本文将主要以多重荧光图像来做操作介绍。
在完成前期创建项目、导入图片、绘制好需要分析的Annotation以后，就进入细胞核的识别。
📌Tips 1：如对前期创建项目、导图等操作不熟悉，可查看攻略👉QuPath使用指南①：下载安装、项目创建与图像导入
📌Tips 2：对于荧光样本，我们需要先确保肉眼能够正确区分阳性信号，可以通过调节伪彩的背景和强度来帮助区分（如何调节请参考此篇👉QuPath超多标看图攻略），在后续设置识别参数时，都是首先基于肉眼主观判断，因此对于数据分析，首要条件就是一张优秀的染色图像，其次就是要求操作的人能够有一定的生物病理学基础，对信号有判别的能力。
📌Tips 3：一般执行数据分析，为了让软件能快速运行，避免卡顿浪费时间，首先会选定一个或几个相对典型的小区域（如何绘制小区域，请参考攻略👉QuPath使用指南②：界面认知与基础标注），进行细胞核、阳性等参数设置，我们称之为建立一个分析模板，后续执行全片或更多区域分析的时候只需要应用同一个分析模板直接进行分析即可。
一、定义细胞分类（Setting up the classifications）
为了后续能够对每个细胞进行阳性检测，在开始参数设置之前，我们需要先建立各个荧光通道相对应的检测类别。
🟢选择Annotations标签-Class list-Populate from image channels，选择保留或不保留现有的一些分类标签。
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二、细胞核参数设置与计算
🟢菜单栏-Analyze-Cell detection-Cell detection...
参数介绍与设置
第一部分：Setup parameters
Detection channel：检测通道选择，选择细胞核染色通道（一般为DAPI）
Requested pixel size(μm)：设置分析分辨率，越小越精细，但计算量大（荧光一般 0.25-0.5μm）
第二部分：Nucleus parameters（核检测）
Background radius(μm)：背景半径，越大对低密度区域平滑越明显（8-12μm）
Use opening by reconstruction：去除小噪点，避免把孤立亮点误判为核（一般勾选）
Median filter radius(μm)：中值滤波去除单像素噪点（0-2μm）
Sigma(μm)：高斯滤波半径，用于增强核形状，防止多个核粘连识别成一个（1-2μm）
Minimum/Maximum area(μm^2)：排除过小/过大颗粒被识别成核（默认参数可以不动）
第三部分：Intensity parameters（阈值）
Threshold：亮度高于此值才被识别为核（可以先默认参数，再根据识别效果调大或调小）
Split by shape：对聚合在一起的核进行形态学分割，避免多个核被识别为一个（一般勾选）
第四部分：Cell parameters（细胞扩展）
Cell expansion(μm)：从核向外扩展形成“细胞边界”，该边界宽度与后续膜质阳性信号识别密切相关，只有边界范围内的信号才会被软件识别
Include cell nucleus：保留核区域在细胞对象中，方便后续统计阳性/密度等（一般勾选）
第五部分：General parameters
Smooth boundaries：对细胞边界做平滑，避免像素化锯齿（一般勾选）
Make measurements：自动计算核面积、强度等参数，便于统计分析（一般勾选）
📌Tips：设置完核通道以后可以先用默认参数Run一下，看看识别的效果，根据效果再进行参数微调。
🟢Step1 ：打开通道调节窗口，显示灰度图，方便观察识别效果
🟢Step2 ：默认参数直接Run一下，观察效果。（注意Run以后如果什么效果都没看见，可以在工具栏中显示一下识别框）
🟢Step3 ：评估识别效果，发现有一部分弱表达的细胞核没有被识别上，以及细胞膜质的范围太大，另外有一部分细胞分割不太好，多个细胞被识别成了一整个。
📌Tips 1：整体识别的过程肯定是无法做到100%完美，让尽可能多的细胞核被准确识别圈选上就可以，因为当我们盯着某一群细胞死磕参数的时候，可能有另一群跟它形态不一致的细胞就识别不精准了，参数的设置一定要服从多数。并且参数数值没有具体标准，不同切片参数也会不一样，以每次调整以后Run的效果为基准。
📌Tips 2：这一步获得的数据核心取决于图像导入后设置的像素尺寸大小，一定要设置准确的像素尺寸，才能在检测中获得准确的数据。
🟢Step 4：数据结果查看，在工具栏的Table图标下拉选择Shoe detection measurements，就可以看到框选的annotation里面每个细胞的数据结果；
另外也可以通过菜单栏的Measure-Show measurement maps，在图像中查看各通道的识别效果。
三、阳性信号检测
关于阳性信号的检测，官方介绍了两种方法：
1、简单阈值法
🟢菜单栏-Classify-Object classification-Create single measurement classifier
🟢参数调整（见下图）
📌Tips：在Measurement的选择中会有Nuclear、Cell、Cytoplasm，这个意思是让软件统计是位于核识别圈内、细胞整体、还是核周扩展区的信号，那就取决于我们使用的一抗的细胞定位，对于核表达的抗体，选择Nuclear几乎毋庸置疑，而膜或者胞质表达的信号在真实的染色中往往难以界定，尤其是胞质，往往除了核周扩展区有类似膜的圈状信号，也有部分信号会入侵细胞核，这时候就可以考虑选择Cell。
保存完成以后，可以继续选择其他的Channel进行参数设置与保存，直到完成所有。
📌Tips：因为阳性信号的识别圈是系统自带的红色+通道颜色，当我们荧光通道本身设定的颜色也是红色时，无法区分阳性和阴性，因此我们可以事先更改掉默认的红色：菜单栏-Edit-Preferences-Objects-Default object color，更改成一个荧光伪彩中不怎么用到的颜色。
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2、机器学习法
①第一步依旧是进行细胞核识别检测（这步必须要做！！）
🟢菜单栏-Analyze-Cell detection-Cell detection...
②创建训练图像
🟢菜单栏-Classify- Training Images-Create duplicate channel training images
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这个时候在左边的窗口可以看到多了几张图片，分别对应不同的通道。这时候可以双击每一个图片观察是否有Cell detection以后的识别圈，如果没有的话，就要从前面Cell detection步骤开始看一下是否是没有进行细胞核识别检测，然后再重新创建训练图像。
③训练每个单通道的阳性识别分类器
1️⃣双击打开需要训练的通道图像
2️⃣Brightness & contrast-选中细胞核通道+目前需要识别的阳性通道（保持画面的纯净，帮助分辨阳性信号）
3️⃣选择合适的圈选工具，把图中阳性的信号圈出来，可以适当多圈几个，让机器训练能更准确识别阳性。
同理设置阴性细胞。
4️⃣菜单栏-Classify-Object classification-Train object classifier
点击Live update观察识别效果，如果效果差不多准确，就输入分类器名称后保存即可；若准确度比较差，要回到第3️⃣步，多画一些识别圈，或者删减掉一些不是很特异的识别圈，再尝试重新训练。
5️⃣重复以上1️⃣-4️⃣的步骤，直到完成所有单通道的识别训练。
④合并分类器
🟢双击原始图像，回到原始图像中；菜单栏-Classify-Object classification-Create composite classifier...
🟢点击双箭头，直接选中所有已经设置过的分类器，编辑输入一个名称后，点击Save&apply。
随即得到一张带所有通道识别效果的符合图。
在图片上右键-Cells，可以选择不同的查看形式，比如选择Cell centroids only，就会见如下图所示效果。
➡️ 
⑤数据结果查看&导出
1️⃣可以直接在软件里面看到每个细胞的数据
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2️⃣菜单栏-Measure-Export measurements...-选择要导出结果的图片，改变储存位置和导出形式以后，导出即可。
➡️ 
表格中的数据结果可以看到总细胞数量、单阳性细胞数量、以及对应的多阳性细胞数量等。
小结
在本篇中，我们围绕QuPath细胞检测的核心流程进行了系统讲解：以细胞核识别为起点，通过调校像素分辨率与核分割参数，实现对绝大多数细胞核的准确定位，再依据Cell expansion定义细胞整体边界，为膜/胞质信号定量打下基础。随后介绍了两种阳性检测策略：基于阈值的快速分类法，以及依托“机器学习”的通道独立训练与复合分类器方法，可分别适配不同染色质量和分析需求。最终，无论是细胞总量、阳性比例、还是多靶标共表达，都能灵活提取并导出，为后续统计分析提供可靠数据支撑。
下篇预告
在多标荧光与数字病理分析中，将完整组织切片合理分割为肿瘤区域、间质区域以及其他组织学成分，是后续免疫细胞定量与空间关联分析的前提。下一篇将系统介绍如何利用 QuPath 的像素分类（Pixel classification）与机器学习模型，实现宏观组织结构的自动识别；并解读分区结果如何作为统计单元参与后续定量分析，为空间免疫特征提取提供更加贴近真实病理结构的依据
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