1，什么是类器官

类器官（Organoids）是器官特异性细胞类型的3D细胞集合，这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out) 和空间限制性的系别分化而实现自我组建。类器官满足以下特点

• 必须要有不同的细胞类型
• 表现出器官特有的一些功能
• 组成应该和器官相似

2，类器官的优点？

• 直接来源于患者供体或者实验动物本身，表征与供体更一致
• 临床一致性高，阴性预测率100%，阳性预测率近90%
• 周期短，可高通量药物活性筛选
• 满足从体外到体内科研实验

3，类器官原代遇到的问题？                            

• 组织初步判断： 样本细胞活性大于等于25。                               
• 消化时间的控制：对于肿瘤样本来说消化时间在20-120min。
• 组织样本的保存：样本运输体外离体时间小于72h。

4，在没有新鲜组织的情况下，可以用冻存组织提取的原代细胞进行3D培养吗？

答：文献虽有报道可以冻存组织进行2D或者3D培养，成功率较低，特别是对类器官的培养对细胞活性要求相对较高，不建议组织冻存后进行类器官培养。

5，类器官培养过程中，提取原代细胞后，红细胞需要去除吗？

答：肿瘤组织中本身含有（如：肝，肺等组织）大量红细胞。首先，可以在拿到组织后尽量多清洗几次，能够去除大部分的红细胞；其次，可以使用商品化的红细胞裂解液，也可以不做红细胞处理。

6，类器官冻存的时间和代数选取？

答：类器官冻存建议体积控制在200μm以内，冻存可以选择P2代以后的代数。

7，类器官最快多久可以构建成功？

答：肠道类器官生长速度较快，1-2h可以观察到类器官形态。

8，目前可以通过那些手段辅助鉴别类器官？

答：目前通用的是明场显微镜和病理染色观察形态；结合基因测序可以鉴定所培养的类器官是否有丢失和供体来源的一致性。

9，类器官和肿瘤球有什么区别？

答：类器官包含多种不同类型的细胞，可以在体外自我分化自我组装，具有干性可以进行传代；肿瘤球为单一细胞系通过外=外界物理条件成球，且肿瘤球在后期培养过程中，中间部位会因氧气，营养不足而出现部分死亡。

10，如何避免原代培养中的污染问题？

答：动物源性的样本一般比人源的更容易污染，尤其是一些胃肠、泌尿系统，培养过程可以添加3-5%庆大霉素或者青链霉素，实验室常用抗真菌试剂。

 1，抗生素对原代类器官培养的影响？

答：用P/S处理干细胞24小时使细胞活力降低30%左右，高倍抗生素的使用还会影响细胞转录活性和分化，这些改变影响类器官内的细胞层次结构，并影响干细胞的活力和生长速度。

2，药筛常用的指标有哪些？

答：目前的筛选是明场图片和一些指标相结合，一般采用IC50，AUG。

3，为什么类器官不会缺少营养？是因为长在基质胶里吗？

答：类器官具有多种细胞类型相互作用，模拟体内呼吸营养摄取，保证类器官的稳定性。

4，组织来源的类器官和ipsc的有什么区别？

答：组织来源的有伦理的问题，不过培养速度快，对临床和药物研发筛选更接近人体，IPS主要是干细胞诱导的，周期比较长，优点在于纯度比较高，但是一般不能传代，目前也可以在3周构建出比如肝胆管类器官。

5，组织的大小和体积有什么要求吗？

答：新鲜胸腹液：  50~100 mL，低温无菌保存。

手术样品：  体积大于黄豆大小，非纤维化激化灶（越大越好，于肿瘤边缘，12点、3点、6点与9点方向，各取一块)，装入样品瓶，4度保存，标明样本信息，冷藏运输；穿刺样品：长于2 cm，装入样品瓶，4度保存，标明样本信息，冷藏运输。

6，类器官和肿瘤球哪个在药筛中使用更广泛？

答：类器官做药筛是目前的一个新的趋势，随着数据的越来越完善，后续应用会更广泛一些。

7，类器官培养到什么时候可以加药？

答：一般建议是长到200-300um可以加药，传代至第2代或者第3代开始药敏试验。

8，IC50与临床用药浓度有什么联系？

答：IC50 主要是对药物敏感性的判断，与用药的浓度是有一定关系的。

9，类器官药筛中是如何选择药物的？浓度范围多大？

答：举例：如果是检测化合物，化合物中都有IC50值，扩大100倍，按照预定的倍数稀释或者增高，一般建议浓度梯度6个或者更多；或者根据血药浓度进行换算。

10，PBMC或者T细胞和类器官共培养还需要添加基质胶吗？

答：基质胶会阻碍免疫细胞与类器官的结合，建议运用悬浮的方式进行类器官的共培养。

1，药筛怎么做正常组织类器官对照？

答：用DMSO做对照即可。

2，类器官培养冻存后一般可以传几代？冻存需要有特殊的细胞冻存液吗？

答：主要看类器官的干性，干性比较好可以传20代以上；冻存液需要类器官专用的无血清冻存液。

3，类器官培养2-3天直径可以达到多少，最大体积可为多少

答：主要看类器官生长的情况，一般是100-200um.如果类器官初始体积就比较大，直径会更大一些，目前类器官的大小可达到4-5mm

4，组织养成的类器官多次传代，可以用于提出肿瘤原代细胞吗？

答：原理上是可以的，把基质胶铺薄一些让其贴壁，再把培养基换成常规血清培养基。

5，组织提取的原代细胞只能传代3-5次，为什么类器官可以传很多次？

答：因为原代细胞是单一细胞，一些增殖的基因会起到抑制作用，但是类器官中是有干细胞的，每一代的类器官中都有一些具有干性的原代祖细胞，所以可以一直传代，而且类器官的培养基可以保持细胞干性，抑制其分化能力。

6，加药后如何判断药物敏感性？用哪些方法检测？

答：一种是观察明场图片，另外就是终点法，像比较常见的CCK8、ATP细胞活性检测、活死染色法也可以。

7，检测IC50一般采取什么方法？

答：比较常见的是CCK8检测、ATP细胞活性检测、活死染色法

8，做实验选用第几代的类器官比较好？

答：建议3-5代是比较好的，或者根据实验来选择代数。

9，类器官直径多大是可以加药？第几天可以测ATP

答：类器官直径在200μm左右;建议是在加药后120小时左右测ATP。

10，老鼠人源肿瘤肺转移模型可以做类器官吗？

答：这种属于肿瘤球构建

 1，类器官传代怎么消化？

答：有专用的类器官消化液，还可以借助一些机械的消化手段，一般是2-3min,不建议用胰酶消化。

2，类器官可以分泌外泌体吗?

答：可以的，但是不用体系和类器官种类纯度是不一样的

3，很多药物对类器官的渗透深度有限，如何保证可以进入到200- 300um深层的位置？后续染色pi染色可以渗透到最内的深度吗？

答：药物并一定要渗入到深层，作用一部分的就会起作用，因为类器官之间是相互作用的，这一点区别于肿瘤球，主要是肿瘤球中间是没有缝隙的。

4，不同器官来源的类器官形态差别大吗? 都是腔状结构吗?

答：差别比较大的，每个类器官的形态都是有一定的区别。

如图：

5，加药后展示变化明场图片一般时间间隔多久要拍一次？

答：建议每2天拍一次，培养过程多进行观察，有条件可以每日观察。

6，如何在药筛过程中保持孔间一致性？

答：每个孔建议是50个类器官，类器官计数相对困难，每个孔多少还是会有差距，也可以把类器官消化成单个细胞进行计数（对类器官的状态要求比较高）。目前我们常用的是艾利特公司的countstar。

7，类器官可以直接在基质胶里染色吗？

答：不建议这样操作，建议把类器官悬浮在缓冲液或者培养基中进行染色。

8，离心机的选取和离心力有什么特殊，为什么类器官越传越少？

答：不同厂家离心力不同，提议自己摸索实验室转速，可以适当提高转速2000转以内对类器官培养没有太大影响。在离心回收时，会有很多类器官粘附在离心管壁，会造成类器官的丢失，建议建议采用水平转子离心机。

9，PDO实验可以代替动物模型（PDX）吗？

答：PDO和动物模型各有优缺点，例如成本低、耗时短、可以进行大规模培养和实验等。动物模型在药物代谢、转移更有优势。两者互相结合是跟更好选择。

10，类器官的生物学重复如何界定?

答：传统2D培养为3复孔重复，类器官的生物学重复目前为两种观点：1，按照2D培养方法设置重复孔来进行生物学统计，2每个类器官可认为是一个独立个体，根据研究目的来设置。按照目前的文献发表和数据支撑，第一种为目前的主流观点。

 1，对于转移部位肿瘤的类器官，该如何选择培养基？

答：一般来讲肿瘤转移至某个部位，表明更加适合他生长，不过在现实中的选择其实原发和转移部位的培养基都适合，个人建议采用转移至部位的培养基。对于肝转移类器官的培养：采用不同于其他部位的培养基，原发性都可以。

2，如何从基质胶回收类器官，化学材料水凝胶可以用来培养类器官吗？

答：缓冲液维持在0-4°，有条件可以借助辅助仪器，不建议将类器官放置在冰上容易污染，待基质胶融化后离心进行回收，这种方式适用于不需要将类器官结构完全打散的情况；传代时不建议使用回收液，在做病理收集时可以考虑使用回收液。

至于化学材料水凝胶应该是未来的趋势：因为他们成本明确，更容易GMP大规模生产，更适用于临床，不过化学材料水凝胶还是有一定的道路走。

欢迎补充！经采纳可得随机盲盒一个！